Génsebészet: a restrikciós endonukleáz enzim hatásai?

1. Dehogynem, elvégre hasítja a DNS-t, ez már károsodás. :) (Persze ha pl. baktériumba ültetünk be egér gént, akkor az emberi DNS-t nem károsítja. De ez gyenge vicc, bocs.) Olyan nagy hígításban adják (ezt számításokkal meg lehet határozni), hogy ne hasogasson agyba-főbe minden felismerőhelyen, hanem adott szakaszon kb. egy hasítást végezzen, és akkor ezt az egyet pont a legjobban illeszkedő felimserőhelyén fogja megtenni. Ezért némi számolgatás, illetve molekuláris biológiai ismeret kell ahhoz, hogy meghatározd, egy gént milyen restrikciós enzimekkel fogsz kivágni. Szép paletta van belőlük. (Nem jut eszembe, melyik cég reklámozta az enzimjeit "Gene-technology is like child's play today!" szöveggel, de ez sokat elmond.) Természetesen ez nem egzakt, mindig lehet máshol hasítás, ezért a kérdéses régiót előtte amplifikálják PCR segítségével, ezzel is szűrve a hibalehetőséget (nagy számok törvénye). Sosem egy darab DNS-en dolgoznak, mindig van PCR előtte, az eredeti mintát utána nem piszkálják.

2. Tapadós vég (sticky end): az enzim kétféleképpen hasíthat: tompa véget hagy: ilyenkor azonos ponton végja el a két szálat. Képzeld el a DNS két szálát úgy, mint két egymásra pakolt legó-sort. Tompa végnél a hasítási vég tompa, azaz nem tudsz hozzá több legó-kockét illeszteni egyik oldalon sem, az mindig két legó-darab lenne. Ragadós végnél maradnak kiálló legó-kockák, amikhez tud újabb legókat illeszteni, és összetapadnak, egy legó-sort képezhetsz. A tapadós vég kb. négy-hat túlnyúló bázispárt jelent normális esetben. A kérdés második felének értelmezéséhez vagy nagyon késő van, vagy nem értem, mit akarsz megtudni... Milyen komplementer szál előző párja? (Csak remélni tudom, hogy a válasz eleje megadta a kérdésre a választ, mert ezt tényleg nem értem. Az "előző párja" kifejezés nagyon zavaró.)

A szabályozó régiók - nem mindig. Ha a kifejeződés in vivo mértékét nézik, természetesen az eredeti szabályozó régióval együtt fogják kivágni, de ha pl. más expressziót kívánnak adni neki, vagy a promóter erősségét vizsgálnák, akkor más szabályozó komplexet kap (pl. konstitutív promóterrel hajtanak nagyon sok mindent, aktin-promóterről van ilyenkor szó: állandóan pörög, termeli a fehérjét). Nagyon sokféle lehetőség van, nem mindig a saját szabályozó komplexét kapja, és ha azt, akkor sem feltétlenül az egészet (pl. csak a promótert, vagy egyes aktivátor elemeket).

Exon-intron: van ún. exon-intron határ, és ezt speciális e.-i. határszekvenciák jelölik ki (nem mindig pontosan jósolható, de jobbára). Vagyis maga a DNS befolyásolja, az ide kötődő fehérjék/riboproteinek (a spliceosoma tagjai) csak katalizálják a folyamatot. Léteznek önkivágó intronok is. Ehhez a gén szabályozó régióinak nem sok köze van, de ez az alapeset. Ugyanis pont az ilyen intron-exon határok tologatásával lehet remek szabályozásokat csinálni (ha még nem tanultad, de fogod, akkor Drosophila szex-determinációs kaszkád, ajánlom majd figyelmedbe, ott vannak ilyenek bőven), de ez már bonyolultabb téma.

"kérdés, az emberi dns nem károsodik ilyenkor?"

Nem tudom miért gondolod bajnak, ha károsodik a DNS. Itt egy mintáról beszélünk, például egy emberi vérminta, amiből először kivonták a DNS-t. A vérmintát adó személyt semmiben nem befolyásolja, hogy a tőle levett vérrel mit művelnek. A DNS kivonásához az adott vérmintát teljesen tönkre kell tenni, lúgban meg mosogatószerben (SDS) feloldani, tömény sóoldattal és tömény alkohollal kezelni, ami minden élő sejtet elpusztít. Amit a végén kapunk, az színtiszta DNS, abból már soha nem lest újra emberi vér.

Ezt a színtiszta DNS-t hasogatják utána enzimekkel. Természetesen az enzim ripityára vágja a DNS-t. Vagy ha egy konkrét szakasz érdekli őket, akkor előbb csinálnak egy PCR-t és csak azt hasítják, de ekkor a restrikciós hasítás csak a PCR terméket érinti. A restrikciós hasítás nem érinti a két végpont közti DNS-t, ha ez érdekel, azaz nem okoz pontmutációt.

"2.nem értem a tapadós vég fogalmát."

Hát ehhez először is vegyünk egy általános DNS szekvenciát, mondjuk azt, hogy

ATGGCCTAAAG. Ez ugye csak az egyik szál szekvenciája, ehhez jön a másik szál, minden T-haz A, minden C-hez G, stb. Ezt általában így ábrázolják:

ATGGCCTAAAG

TACCGGCTTTC

Csakhogy ez egy hibás és férevezető ábrázolás, mert a DNS-t 5’-től 3’ irányba olvassuk le, így a felső szál eleje valóban ATGG, de az alsó szál fordítva fekszik, ott az 5’ a jobb oldalon van, azaz CTTT-vel kezdődik, nem pedig TACC-vel!

Ezért itt ez a kép, hogy jobban átlásd:

[link]

Ha a DNS-t így képzeled el, akkor rögtön jobban látszik, hogy hogyan működik a hasítás. A tompa végnél ugye egy sima DNS-ből két DNS-t kapunk, mindkettőnek van alsó és felső szála, mindegyiknek van 5’ és 3’ vége. Utána már nem írtam ki a végeket, csak azt ami fontos, de természetesen továbbra is ott van mind.

Mint látod, ragadós végből kétféle lehet, 5’ és 3’, attól függően, hogy az enzim milyet vág. Azt is fontos látni (ezért jó a fektetett ábrázolás), hogy ha az egyik szálon 5’ marad, akkor a másik szálon is 5’ marad.

Utána amikor össze akarjuk ragasztani a végeket, akkor ugyanolyan ragadós véget kell csinálnunk a két összeragasztani kívánt DNS-re. A szétvágott darab persze újra is egyesülhetne, hiszen a szétvágás nem egy örökre szóló valami, a DNS két vége nem tudja, hogy valaha összetartozott-e vagy sem, úgyhogy mielőtt össze akarjuk ragasztani (azaz ligálni) a végeinket, azelőtt a szükségtelen részt el kell távolítani.

A valósághoz hozzátartozik, hogy az általánosan használt restrikciós enzimek palindrom szekvenciákat vágnak, azaz olyat, ami mindkét szálon ugyanaz a szekvencia, és emiatt a túlnyúló végek egyezőek lesznek. Ha megnézed ezt a képet,

[link]

látod, hogy egy AT túlnyúló vég sem kompatibilis egy másik AT véggel, ha az egyik egy 5’ AT, a másik egy 3’ AT. Viszont egy adott enzim által vágott összes vég kompatibilis lesz (hisz például kizárólag 5'AT-t vág), tehát ha egy enzimmel elvágunk két DNS-t, akkor összesen 4 olyan végünk lesz, ami bárhogyan összetapadhat. (Megjegyzem, hogy a túlnyúló végek jellemzően nem 4-6 bázisnyiak, azok a teljes felismerőhelyek. Általában 1-3, ritkán 4 bázis a túlnyúló.)

Tehát tegyük fel, hogy a követező ábrán kék vonallal jelölt gént rá akarjuk juttatni egy plazmidra (kör alakú DNS, remélem tudom mi). Tudjuk, hogy a gén két végétől nem messze van egy A-enzim és egy B-enzim hasítóhely, és a plazmidon is van egy-egy ilyen hely. A plazmidon színes körrel kiemeltem két adott helyet a követhetőség kedvéért.

[link]

Ekkor a plazmidot és a gént tartalmazó DNS-t is elhasítjuk mindkét enzimmel. A hasításból egy halom DNS-darab fog keletkezni, melyben bármely a-jelű bármely másik a-jelűvel össze tudna állni, valamint ugyanez igaz a b-jelűekre is. Ezért elválasztjuk a nekünk kellő darabokat, és összekeverve csak a célplazmid a-jelű vége lesz a génes darab a-jelű végéhez, és a b-vel is ugyanez a helyzet. Természetesen a ligálás újra létrehozza a hasítóhelyeket. Ezért a ligálás után egy olyan plazmidot kapunk, melyen van egy A és egy B hasítóhely, de köztük az eredeti kis DNS darab helyett a kék gén van.

„beültetnek egy adott gént, ez a gén tartalmazza a szabályozó régiókat?”

Attól függ, milyen gént, honnan, mibe ültetünk, milyen céllal. Ezt már kísérlete válogatja, ugye nem csak emberi gént vihetünk mondjuk egérbe, hanem baci gént másik baciba, növény gént baciba, növényt másik növénybe, egeret baciba, bacit egérbe, egeret növénybe, stb-stb-stb. Amit csak akarunk. Például a GFP, azaz zöld fluoreszcens fehérje (green fluorescent protein) egy medúzából származó gén, és előszeretettel viszik be mindenhova különböző céllal. Pl ha szabályozó régió nélkül juttatjuk be egy élőlénybe egy ismeretlen szabályozó régió mögé, akkor vizsgálhatjuk, hogy az adott szabályozó régió melyik szervben és melyik időpontban működik: ott és akkor lesz zölden világító az adott lény, ahol és amikor az adott régió bekapcsolta a GFP-t. Ha ellenben szabályozó régióval együtt visszük be, akkor mást vizsgálhatunk. Ha egérbe visszük, akkor kaphat intront, ha baciba, akkor csak a kódoló szekvenciát használjuk.

„az exon-intron mechanizmust a dns-ben lévő szabályozó régiók befolyásolják, esetleg más?”

Az intron kivágódását az exonról javarészt az intron szabályozza, ez vonz oda mindenféle kivágó cuccokat. Mai tudásunk szerint azonban az exon is szabályoz valamennyire. Persze azt ne feledd el, hogy ez nem DNS-szinten, hanem a róla másolt RNS szintjén zajlik, de mivel az RNS a DNS-ről íródik (vagyis egyezik a szekvencia), ezért gondolkozhatunk a témán DNS-szinten is. De magából a DNS-ből sose vágódik ki intron. A lényeg, hogy a gének egy része olyan intront tartalmaz, ami képes kivágni saját magát az mRNS-ből, de a legtöbb intron nem ilyen. Ezek különböző faktorokat igényelnek, amiket az intronban levő szekvenciák illetve az intron-exon határon levő, de az exonban levő szekvenciák vonzanak oda. Ennek a folyamatnak egyébként nagyon pontosan kell zajlania, mert ha egy bázissal odébb vágódik ki az intron, akkor az elrontja a leolvasási keretet (eltolja a tripleteket egy bázissal), éppen ezért van egy pár nagyon fontos kulcs bázis, aminek mindig lennie kell az intronban.