Molekuláris biológia kérdés. Mit tegyünk, ha az inszert és a vektor nem kompatibilis?

Nem kompatibilis alatt akkor gondolom azt érted, hogy a vektorod vége mondjuk 5' túlnyúló, mindkét oldalon, az inszert pedig tompa végű és ezért nem kapcsolódik.

Szerintem nem egy folyamat lépéseit írja le a megoldás, hanem hogy ha 5' túlnyúló véged van, akkor mit csinálj, vagy 3' akor mit.

Az 5' túlnyúló végeket bármelyik polimeráz visszaemészti exonukleáz tulajdonsága miatt, 5'-->3' exonukleáz aktivitással.

A 3' túlnyúló véget pl T4 polimerázzal emésztheted vissza, aminek 3'-->5' exonukleáz aktivitása van. Minden polimeráznak van 5'-->3' exonukleáz aktivitása, de 3'-->5' exonukleáz aktivitása csak bizonyos polimerázoknak (pl T4 polimeráz) van.

Ha nem visszaemészteni szeretnéd a szál végét, akkor fel is töltheted polimerázzal.

Mindhárom esetben tompa végeket kapsz, ami már kompatibilis.

Szerintem ezt jelentheti a leírásod, de régen volt már molbiom... :)

Az overhang túlnyúló véget jelent. Kétféle túlnyúlás van, 5' és 3', lásd az alábbi rajzot.

[link]

A T4 polimeráz úgy jön ide, hogy van neki egy hibajavító funkciója, le tudja vágni a saját maga által hibásan beépített DNS-t. Mivel az ilyen hiba mindig 3' túlnyúló bázis, ez a hibajavítás tuladonképpen egy egyszálú DNS specifikus 3' DNáz aktivitást jelent, azaz a 3' túlnyúlót bázisonként visszaemészti. A kétszálú DNS-t békén hagyja.

Az 5' esetben a következő a helyzet:

[link]

Az 5' túlnyúlást ugyanúgy vissza lehet vágni, mint a 3'-t, vannak megfelelő nukleázok. Viszont ezt fel is lehet tölteni, mivel a polimeráz magát túlnyúlást használva templátként ki tudja egészíteni a rövidebb szálat. A polimerázok csak 5' > 3' irányban tudnak írni (másképp mondva a 3' véget folytatják), így csak 5' túlnyúlás esetén van lehetőség a töltésre.

A részleges töltést akkor lehet alkalmazni, ha megfelelőek a szekevnciák. A képen látható esetben ha a feltöltési reakcióban csak C-t adunk a polimeráznak, akkor nem fogja feltölteni a túlynúó T-t, azaz marad egy darab túlnyúlásunk, ami kompatibilis lesz egy A-val.