Pl. Klasszikus szekvenálás esetén, miért csak a szekvencia végét határozzák meg?

"(ezt pl. nem értem teljesen, azt akár a 100-200 ezer darab szakaszt külön-külön klónozzák egy-egy vektorba? Ez rengeteg munka :D)"

Ez baromi nagy munka volt, pl az egér BAC könyvtárat ha jól emlékszem 5 évig tartott összerakni és millió eurókba került. Viszont szerencsére nem egyesével kell csinálni. Gondold végig, ha egy enzimmel feldarabolunk egy genomot, akkor kapunk egy DNS-keveréket, ami az adott genom darabkáit fogja tartalmazni, és mindegyiknek az adott enzim által képzett ragadós vége lesz. Ha ezt a masszát összekeverjük egy adag "üres" BAC-kal, amit ugyanezzel az enzimmel linearizáltunk, akkor olyan BAC klónokat fogunk kapni, melyek mindegyike egy-egy genomdarabot tartalmaz, de gyakorlatilag minden BAC másikat. Nyilván ezt többféle enzimmel is el kell játszani és hát addig kell csinálni, amíg le nem fedtük a teljes genomot. A BAC-okat valami kódnévvel látják el (pl.: FH150KJ), aminek semmi köze ahhoz, hogy pontosan mit is tartalmaz az adott BAC, ez egyszerűen csak egy sorozatszám. És itt jön képbe először a FISH.

" "FISH technológiával, fénymikroszkóp alatt megtudták határozni, hogy melyik kromoszómához és annak melyik részéhez kapcsolódik az adott BAC klón" > ez a kapcsolódás miért is jó nekünk? Meg hogy tud kapcsolódni egy pl. cirkuláris plazmid+a vizsgált szekvenciadarab komplexünk egy lineáris szekvenciához?"

Van egy baromi hosszú DNS darabod, amiről először csak úgy nagyjából akarod megmondani, hogy az adott élőlény (mondjuk egér) melyik kromoszóma mely szakaszát tartalmazza. Szóval tudni akarod, hogy az "FH150KJ" nagyjából mit tartalmaz, ezért megfelelőfestéssel mondjuk kékre fested, és összekevered izolált egér kromoszómákkal, és nézed, hogy hol van kék festés. A bázispárosodás miatt a BAC oda tud tapadni a kormoszómához (ezáltal odaviszi a saját kék festékét), így tudni fogod, hogy az egér 1-es kromoszóma P karjának közepén van, azaz innen származó darab van a BAC-ban. Azt is látod hogy van még 5 BAC, ami a szomszédságában van, illetve részben átfed vele. Akkor már tudod, hogy ezek öten részben átfedő vagy nagyon közeli darabokat szedtek föl a "masszából". Illetve azt is látod, hogy ha egy darab még hiányzik, mert oda nem tapad BAC.

A BAC amúgy úgy tapad oda a kromoszómához, hogy mindkettő DNS-ből van, így bázispárosodni tudnak. Nyilván ehhez a kromoszómának is egyszálúvá kell válnia (felnyílni), és a BAC-nak is. Az nem baj, hogy az egyik cirkuláris, mert ez a felnyílás amúgy is csak lokálisan történik meg, azaz pár ezer bázisnyi helyen. Ez már elég a FISH-hez. De amúgy is lehet linearizálni a BAC-ot, azaz egy enzimmel megemészteni, hogy lineáris darabokat kapjunk. Sőt, őszintén szólva a FISH-hez nem értek annyira, lehet hogy ezt mindenképp megteszik. De mindegy, mert mint mondtam, a DNS egy nagyon flexibilis molekula, és az hogy a közepén párezer bázis hozzápárosodik egy másik példányhoz, akkor is végbe megy, ha százezer bázissal odébb körré zárul az egész. (A DNS nem tudja, hogy eredetileg melyik volt a saját komplementer szálja, ha hozzákeverünk BAC-okat, amin van komplementer szakasz, akkor összetapad vele és kész.)

"BAC klónok feldarabolása 1-2 ezer bp -os darabokra, amiket szintén beklónoztak (???), majd meghatározták a szekvenciáját mindkét oldalról >"

Ezt meg azért csinálják, mert a BAC klónt nagyon nehéz szekvenálni, legalábbis Sanger módszerrel. A BAC nagyon nagy, ezért nehéz a baktériumból kitisztítani, tehát nincs meg a szekvenáláshoz szükséges sok és jó DNS. Ezért feldarabolják, és nagykópiás plazmidba teszik, amin ráadásul ott van mindkét oldalon a Sanger módszer feltétele, az ismert kiindulási pont (primer kötőhely). Így tudják két irányból szekvenálni, nyilván nem egy reakcióban, hanem egyszerre párhuzamosan két csőben. Persze a feldarabolást úgy kell érteni, hogy az adott BAC mindig megmarad, csak felszaporítják a bacit, amiben benne van, egy kicsit elraknak, a többiből izolálják a BAC-ot. Az elrakott mintából pedig mindig újra lehet szaporítani.

" Az első BAC klónok szekvenciáját akkor most meg sem határozták? :D"

Ezt nem tudom honnan veszed. A klónozás előbb létezett, mint az első BAC.

A kontig pedig nem más, mint az átfedő darabokból összerakott DNS. Az átfedő darabos DNS-összerakás is létezett már az iontorrent előtt, amikor még három napba telt egy 500 bázisos darab kézzel való megszekvenálása, és aztán ha találtak egy 50 bázisnyi átfedést egy másik darabbal, akkor kézzel vagy maximum szövegszerkesztő programmal illesztették össze őket. (Amibe persze kézzel kellett begépelni: az egyik diktálta, a másik írta.)

A lambda fágot például még így szekvenálták, párszázas darabonként. Volt az A. B, C D darab, amikben nem volt egy fia átfedés sem. Aztán lett egy E darab, ami jobbról átfedett D-vel, balról pedig A-val (nyilván amikor elnevezték A-nak, akkor nem tudták, hogy melyik darab). Tehát már tudták, hogy DEA így együtt van, ezt elnevezték kontignak. Aztán lett egy F darab, ami összekötötte B-t és C-t, ez lett a BFC kontig. Végül meglett G darab, ami összekötötte az egészet egy BFCGAED darabbá, vagyis a teljes kontiggá. (Megjegyzés: a sztori nagyjából így zajlott, de hogy valójában hány darab volt és milyen neveik voltak, azt most a szemléltetés kedvéért egyszerűsítve közöltem.)

Szóval a kontig az, amikor kirakózol, és találsz pár darabot, ami tutira összeillik. Az is kontig, amikor ehhez hozzáraksz, és az is kontig, amikor kirakod az egészet.

“Van egy olyan technológia, hogy Chip-Seq, melyel transzkripciós faktor kötőhelyek után kutathatunk a genomban > Miért igen fontos ezt nekünk tudni? Csak szimplán a génszabályozás vizsgálható általa?”

A genszabalyozas az nem olyan “csak” dolog. Az a dolgoknak a veleje. Letezik egy olyan megkozelites a biologiaban, hogy probaljuk meg az egesz eletet leirni kemiai nyelven, szamitogeppel modellezhetoen. Ugye a kemia ugy jon ide, hogy minden kotes egyfajta kemiai egyensulyi reakcio, amire a kemia puritan, kokemeny szabalyai vonatkoznak. Koncentracio, egyensulyi allando, stb. Ezek a dolgok egyre fontosabba valnak pledaul egy gyogyszerkutatasban, ahol ma milliokat olnek olyan vegyuletek vizsgalataba, amik aztan vagy jok lesznek valamire, vagy nem. Milyen jo lenne, ha meg tudnam mondani, hogy XY feherje (egy transzkripcios faktor) K mertekben kot a DNS-en ehhez es ehhez a helyhez, sejten beluli koncentracioja ennyi meg ennyi, tehat ha egy gyogyszerrel el tudnam tolni a kotodesi aranyokat mondjuk 10%-kal, akkor XY feherje altal szabalyozott gennel ez es az tortenne. Mivel XY fejherje nem csak egy gent szabalyoz, jo lenne tudni a mellekhatasok miatt, hogy mely mas genek hogyan fognak szabalyozodni a gyogyszer hatasara. Ha egy szamitogepes modellezessel kiderulne, hogy a gyogyszer majd milyen bajokat fog okozni, akkor milliokat lehetne megsporolni. Mit kell ehhez tudni? Az XY feherje altal befolyasolt osszes kotohelyet a DNS-en. Aztan persze azt is, hogy melyiket milyen affinitassal koti, melyiket milyen masik faktor szabalyozza meg, stb.

Az emberi genom gyakorlatilag teljesen meg van szekvenalva. Manapsag mar nem az a kihivas, hogy talaljunk egy ORF-et, tele vagyunk ismeretlen ORF-ekkel, nemelyik csak pszeudogen, fogalmunk sincs olykor, hogy egy gennek latszo DNS szakasz mit csinal. Ma az a kerdes, hogy melyik mit csinal, es hogy melyik hogyan van szabalyozva, melyik gent mi kapcsolgatja es mikor es miert es hogyan. Peldaul az embrionalis fejlodes soran melyik geneket kell szep sorban kapcsolgatni, hogy kinojon egy sziv vagy egy vese. Ha ezeket tudnank, akkor egy marek ossejtbol szepen noveszthetnenk szivet vagy veset. (Mondjuk ilyesmivel probalkoznak ma is, kicsit mas uton.)

“Valamint, ami az RNA-seq -et illeti, csak szimplán a genomban lévő RNS világát vizsgálhatjuk általa és ennyi? :)”

Az RNS-ek fontossagat is alabecsulod egy kicsit.