Pl. Klasszikus szekvenálás esetén, miért csak a szekvencia végét határozzák meg?

Minek a szekvenálásra gondolsz? DNS? Fehérje?

Fehérje esetén az Edman lebontás a fehérje N terminálisról (az elejéről) indul. Itt minden ciklusban egy amnosavat lehet meghatározni, aminek a költsége és az időigénye adott. Ráadásul ha jól tudom, elakad a diszulfidhidaknál. Ezért gondolom sok esetben ha az a kérdés, hogy milyen fehérjém van a mintában, és ez az elsp 10-20 aminosavbólkierül, akkor abbahagyják.

DNS esetén a klasszikus módszer talán a Maxam-Gilbert (bár manapság már a Sanger módszer is ugyanolyan "klasszikus"). A Maxam-Gilbertnél az egész láncot nézik egyszerre, viszont az nem lehet túl hosszú. A Sanger pedig egy adott primer pozíciótól indul, és egy bizonyos méret limitje van, ami úgy kb 800 bp. Ez a reakció és a kapilláris kromatográfia sajátságai miatt van így.

Oké, láthatólag neked ez a dolog elég zavaros, de sebaj, nekem is eltartott egy darabig míg igazán megtanultam "DNS-ül gondolkozni". De ne aggódj, mire neked is meglesz a PhD-d genetikából, addigra neked is menni fog.

Szóval az első és legfontosabb dolog, hogy a DNS szekvenálásnál felejtsd el, hogy te hogyan értelmezed az adott szálat. A DNS ugye kétszálú, és az egyik szál a másiknak a komplementere. Azaz tök mindegy, hogy hogyan olvasod el, elolvashatod hátulról előre és elölről hátra is, ugyanazt kapod. Másként mondva, a DNS egyik szálának az 5' vége ott van, ahol a komplementerszál 3' vége, ezért ha az egyik oldalon elkzeded nézni a kettős szálat, akkor egyszerre foggsz haladni az egyik szálon 5'-3' irányban, a másikon pedig 3'-5' irányban.

Ezen kívül nincs olyan, hogy értelmes szál meg komplementer szál, ezért nem is tudhatod, hogy melyik szál a fontos, tehát nem tudod mihez igazítani a DNS "elejét" meg "végét". Persze midnen egyes gén esetén van egy értelmes szál, de ez nem az egész DNS-re igaz, hanem csak az adott génre. A másik génnek pedig lehet hogy a másik szál az értelmes. Mivel mi emberek (legalábbis nyugati emberek) balról jobbra olvasunk, ezért szertjük a DNS-t is balról jobbra leolvasni, ezért ha találunk egy gént, akkor az adott gén értelmes szálját fogjuk a DNS "elejének" tekinteni, hogy könnyebben tudjunk dolgozni vele. De az nem az eleje igazából. Lehet, hogy a szekvenálási reakcióban az pont a vége lesz, mert a szekvenálási reakció számára mindkét szál pont egyforma, és nem nagyon törődik azzal, hogy mi szeretnénk, ha az ATG a bal oldalra kerülne. (Nem beszélve ugye arról, hogy mint említettem, a gének hol jobbra, hol balra néznek, ezért ha egy irányban végigmegyünk a DNS-en, akkor hol egy gén elejétől a végéig, hol meg egy másiknak a végétől az elejéig fogunk leolvasni - de ez nem baj, mert ugye a komplementeritás alapján meg tudjuk fordítani.)

A génszabályozó elemeket meg nyilván azért említetted, hogy lássam mennyire értesz hozzá, de mivel a szekvenáláshoz és az 5'/3' végekhez sincs sok közük, ezért csak azt látom, mennyire sokat kell még tanulnod.

Lassan érdemes lenne nem azon töprengened, hogy az én válaszom miért hibás, hanem azon, hogy esetleg a kérdés - nem tudom honnan szedted - tartalmaz félrértett vagy hamis információt. Már csak azért is, mert valószínűleg több DNS-t szekvenáltatok meg és olvasok le egy hónap alatt, mint te az egész eddigi életed során.

Mindig minden attol fugg, hogy mit akarsz szekvenalni es mit tudsz rola. A jo szekvenalashoz sajnos jo minosegu es elegendo mennyisegu DNS kell.

A Sanger modszer az ugye egy PCR-szeruseg, csak ket primer helyett egy primered van. Mivel a primernek le kell tapadnia valahol a szekvencian, ezert kell egy kicsike darab ismert szekvencia a szekvenalashoz, ahova a primer tapadni fog. Ha teljesen ismeretlen a minta, akkor ezert kell klonozni, mert ilyenkor beleklonozzuk egy vektorba, amin van egy ismert kiindulasi szekvencia, es onnan elindulva lehet szepen szekvenalni. Amugy a klonozasra azert is szukseg van, mert ez a modszer eleg erzekeny a DNS mennyisegere es minosegere. Elvileg ha van egy nem klonozott, de azert tiszta DNS preparatumod, es azon van megfelelo primer hely amit ismersz, akkor nem kell klonozni. De ez a konstellacio igen ritka. (Ugye a klonozas a DNS minoseget es mennyiseget is noveli, ezzel kielegiti a Sanger igenyeit: nagy mennyiseg, jo minoseg, ismert kiindulopont.)

Az ujgeneracios szekvanalasbol tobbfele is van, nem artana tudni, hogy melyikrol beszelunk. Amugy ezeknel sem baj, ha klonozzak a mintat, foleg ha keves es vacak minosegu a DNS, viszont ezek kozul nemelyik eljaras nem igenyel tul sok vagy tul jo minosegu mintat, olyan is van, ami egy szal DNS-t le bir olvasni. Ezek az eljarasok tobbnyire nem igenyelnek ismert kiindulasi darabot, mivel nem PCR alapu eljarasokrol van szo. (Amugy a jo oreg Maxam-Gilbert sem igenyelt kiindulasi darabot…)

Peldaul az ujgeneracios szekvenalasok kozul a legismertebb az un iontorrent szekvenalas, aminel feldaraboljak a DNS-t, majd egy eleg fura (hidrogen ion eszlelesen alapulo) analizisnek vetik ala a darabokat. Igy lesz egy halom pici DNS-darabod, amik reszben atfednek egymassal (mert a kezdeti darabolas nem mindenhol ugyanugy tortent). Ezeket a darabokat aztan kontigga epiti egy szamitogepes program.

Tudomasom szerint amikor emberi vert (klonozas nelkul) szekvenalnak, ami ma mar letezik mint szolgaltatas, akkor iontorrentet hasznalnak, ami megbirkozik azzal a mennyisegu DNS-sel, ami a mintaban van.

Nem tudom hova teszik belejuk a mintat. Iontorrentet csak egyszer hasznaltam, akkor is csak a szekvenciat kaptam meg, a keszulekhez nem nyultam. De azt tudom, hogy a mintat belekevertek valami speci cuccba, amit az adott gephez kellett megvenni, ebben volt az enzim, nem tudom mifele endonukleaz, ami feldarabolta. (Ebbol ugy szezezer forintos tetel egy adag.) Vegulis egy Eppendorf-csonyi feldarabolt DNS megy a gepbe, amin nyilvan van egy megfelelo nyilas vagy szivoka vagy valami, ami beviszi a folyadekot. A tobbi mar a gep dolga.

Gondolom, a vert nem csak ugy racsoppentik, hanem elobb azert kinyerik a DNS-t. (Vannak olyan kitek, amik cseppnyi verbol is kinyernek egy csomo jo minosegu DNS-t.) Azutan a DNS-t megint hozzakevereik ehhez a gephez valo enzimes cucchoz es mehet a dolog.

A DNS darabolas az teljesen szandekos. Sajnos az erzekelo, ami ezeknek a gepeknek a lelke, nem tud bizonyos hossz felett olvasni. Az 500 az mar egy nagyon jo ertek. Lassuk, mirol van szo egy peldan keresztul. Vegyunk peldaul egy mondatot:

Jozsi bement a szobaba.

Tegyuk fel, hogy egyszerre csak 5 betut tudsz elolvasni, mert egy icipici lyukon kersztul nezed. Mindig amikor benezel a lyukba, leolvashatsz 5 betut a mondatbol, de nem biztos, hogy a kovetkezo 5 betu fog a szemed ele kerulni (hisz olyan pici a lyuk, hogy nem talalsz vissza oda, ahol az elobb voltal). Szoval mit tudsz csinalni? Leolvasni 5 betut, felirni, ujra masik 5-ot, addig, mig biztos nem vagy abban, hogy mindent lattal legalabb egyszer. Ezeket fogod kapni. (A szuneteket alahuzssal jelolom: Jozsi_bement_a_szobaba.)

Jozsi

ozsi_

emen

t_a_s

a_szo

szoba

_szob

zsi_b

i_bem

stb. (Raadasul ezeket ossze-vissza fogod kapni. Nemelyiket tobbszor megkapod, masok akar hianyozhatnak is, ha peched van.) A lenyeg a lenyeg, hogy ha mindenbol kapsz legalabb egy olyan darabot, ami atfed a masikkal, akkor ossze tudod rakni. Tehat a gep fogja a

Jozsi, ozsi_ zsi_b i_bem, emen darabokat, es oszserakja a Jozsi_bemen reszt. Ossze lehet rakni az a_szo, _szob, szoba darabokat is: a_szoba. Sajnos a tobbi hianyzik.

Ugyanez megy a DNS-sel is.: az atfedesek alapjan osszerakjak a teljeset. Hatrany, hogy a DNS-ben ismetlodesek lehetnek, ami problemat okozhat az osszerakaskor. (Jozsi bement a kiszsobabol a nagyszobaba >> lesz egy halom “szoba” es “zobab” darabunk, persze lesznek elkulinoto reszek is, mint “obabo/obaba”, “babol/baba.” De ha egy imsetlodes sokkal nagyobb, mint a gep altal leolvashato darab, akkor azzal elegge meggyulik a gep baja.

Eppen ezert, az iontorrentnel nagy elony, ha van egy un. referenciaszekvencia. Vagyis tudjuk, hogy mit szekvenalunk, tudjuk, hogy milyennek kellene lennie, es csak a mutaciokat keressuk. Embert eseten pl megvan az emberi genom, es a bekuldott mintat arra illesztik. Peldaul ha tudjuk, hogy az eredeti mondatunk a „Jozsi bement a szobaba.“ es ilyen darabokat kapunk:

Jozsi, ozsi_, _emel, t_a_s, a_szo, obab, baban, akkor a Jozsi illeszkedik az eredeti mondat Jozsi-jahoz, ozsi_, stb, de aztan talalunk egy olyat, hogy „emel“, ami csak reszben illeszkedik a „bement“-re. Ha osszerakjuk a mutans mondatot, akkor azt kapjuk, hogy “Jozsi emelt a szobaban.” Hat ugyanigy kapjak meg azt, ha valakinek valamilyen mutacioja van.

Na es pont emiatt, ha nagyobb darabokat tudsz leolvasni, akkor jobb. Ha 7 betu a limit, akkor ilyeneket kapsz: Jozsi_b, ozsi_be, zsi_bem. Sokkal konnyebb vele dolgozni. Meg jobb lenne egy 10 betus limit.