Ha egy kutatócsoport rgy adott fehérjét szeretne kristályosítani, de nem sikerül nekik sok próbálkozás után sem, akkor nagy valószínűséggel azt nem is lehet?

A kutatás nem olyan, hogy akkor mi addog próbálkozunk, amíg fel nem adjuk. A végtelenre nem finanszíroznak semmit. 2-3-4-5 (fakultatíve választható) éves projektek vannak, kisebb-nagyobb finanszírozási alappal. Erre pályázni kell azzal a szöveggel, hogy te a humán KIAA255 fehérje térszerkezetét kívánod meghatározni. Ehhez kell mondjuk kristályosítani a fehérjét. Elfogadják, van öt éved a munkára, ebből egy lejön a beszerzés miatt, egy pedig a cikkírás miatt, marad jó esetben három. Ha három alatt nem produkálsz elfogadható anyagot, bukta. A cikknek meg kell lennie, ezért a fehérjét kívülről-belülről megvizsgálják, írnak róla minden szépet, és ha nem sikerült kristályosítani, akkor ezt beismerik, leírják a félresikerült kristályosítási menetet és paramétereket, majd egy alternatív térszerkezet-meghatározást (pl. in silico) alkalmaznak. Egy másik csoport ez alapján előnnyel indul, mert nekik azt már nem kell végigpróbálni.

A legtöbb kristályosítás "próbálkozás", mert a paraméterek változhatnak. Nem teljesen hasraütés, de néha meglepő. Illetve ha sikerült is kristályosítani - mi van, ha a fehérje natív szerkezete más? Akkor mit értünk vele?

Természetesen vannak rendezetlen szakaszok, vagy rendezetlen fehérjék, amik egy részét - ahogy én tudom - nem lehet kristályosítani (és nem is egy ilyen van!), de ha egy fehérjét lehet is, akkor sem biztos, hogy mindig sikerül egy kutatási projekt alatt.

Ha egy feherjenek van rendes "szerkezete", akkor azt lehet krisztalyositani. Megkockaztatom, hogy minden feherjet lehet. A rendezetlen feherjeknel lehetnek problemak, de, mivel a szerkezetuk fluktual, egy jol meghataozott minimum helyett egy egesz sor alternativ konformacio lehetseges, ott el tudom kepzelni, hogy valamilyen modszerrel feldusithato egy bizonyos populacio (pl. valamilyen kotodes reven) es utana a kristalyositas menni fog.

Ha valakinek hosszu probalkozas utan nem megy termeszetesen nem jelenti, hogy az nem mehet masoknak!

Mielott elindul a paraszt kristalyositani erdemes ellenorizni:

-Mennyire tiszta a feherjeoldat. SDS PAGE-el homogen savot kell latni, legalabb 90-95%-os tisztasagra van szukseg sikeres kristalyositashoz.

-szerkezetjoslo programokkal mekkora a rendezetlen regiok aranya?

-CD spektroszkopiaval meghatarozhato, hogy valoban jo-e a masod es harmadlagos szerkezet.

-CD meres alapjan megtudjuk, hogy milyen homersekleten denaturalodik a feherje, hogy viselkedik a homerseklet novekedesevel. -> nativ-e egyatalan azon a homersekleten, ahol kristalyositani probalunk?

-Gelszureses kromatografiaval megtudjuk, hogy a molekula populacio mennyire homogen. Ha sok csucsot kapunk, vagy szeles csucsot, akkor az azt jelenti, hogy a feherje szerkezetileg heterogen, kristalyosodas nem valoszinu.

Ha ezek kozul barmi nem stimmel, akkor nem fog menni. Sokszor az expresszalt feherjet at kell dizajnolni, hogy a rossz szerkezetu reszek ne zavarjak a kristalyositast. Sikeres csoportok parhuzamosan 5-10 kulonbozo konstrukcioval probalkoznak, es a minosegi tesztek alapjan valasztjak ki a megfelelo jeloltet.

Es akkor meg csak az egyszeru szolubilis, nem komplex feherjekrol beszelunk. Aztan jonnek a komplexek, es a membran feherjek.... :-)

Persze a kristalyosodas nem garancia a szerkezet megfejtesere...

Rendes szerkezet kifejezés alatt döncike azt értette, hogy nem rendezetlen az egész fehérje, azaz nem fluktál a térszerkezete (vagyis meg lehet mondani, hogy itt és itt ilyen és ilyen kötés van, nem az esetek 80%-ban így, a maradékban meg úgy kapcsolódnak).

A natív szerkezet más - ezt csak tippelni lehet. Pl. van egy fehérjéd, amiről bebizonyították, hogy képes kapcsolódni mondjuk a DNS-hez. A térszerkezet meghatározása után meg azt kapod, hogy a konformáció nem tesz lehetővé semmiféle változást, amivel a DNS bármely árkába tudna kapcsolódni. Na, ilyenkor valami gond van. Megesik az ilyesmi, néha egészen apró változásokról van szó.