A CRISPR Módszerrel milyen szinten lehet átalakítani a DNS-t?

1) A mutáns az nem valami sci-fi filmből kilépett zombiegér vagy telepatikus hómacska. A mutáns annyit jelent, hogy egy egyednek (akár embernek) megváltozott a DNS-e a faj szokványos DNS-éhez képest. A DNS nagyon sok ponton tud változni, és ha csak egy ponton változik, akkor is mutáns, ha sok ponton változik, akkor is. Van olyan mutáció, ami semmit nem csinál, de attól még mutáció. Mutáció alatt ne olyanra gondolj hogy valaki tud repülni. A kék szem az egy mutáció (a barna az eredeti). A nullás vér egy mutáció. A laktóz intolerancia a rendes eredeti állapot (bizony), tehát ha valaki tud tejet emészteni, az mutáns. Európában ez a mutáció gyakori, ezért úgy tűnhet, mintha ez lenne a normális.

2) A fajok mutációk felhalmozásával alakulnak ki az ős-fajból, de nem egyik pillanatról a másikra.

3) CRISPR-rel sokféle mutációt lehet csinálni. Kisebb vagy nagyobb deléciókat, inszerciókat, pontmutációkat. Mondjuk lehetne csinálni albínót. Egy albínó egyed az nem egy más faj, az csak egy albínó egyed.

4) A CRISPR-rel nem úgy dolgozunk, hogy a kromoszómát valahogy mikroszkóp alatt buheráljuk, majd bevisszük egy sejtbe. A CRSIPR-t visszük be a megtermékenyített petesejtbe. A CRISPR az nem egy kalapács, amit végig fognod kell a kezedben, és aktívan kalapálnod kell vele a kromoszómát. Inkább olyan, mint egy előre programozott rakéta, amit ha egyszer belősz a sejtbe, akkor magától teszi a dolgát. A "programzást" még a belövés előtt végzed el. Abban is hasonlít a rakétára, hogy néha mellélő, néha meg nem is talál célba egyáltalán. Ha mellélő, akkor is mutánst hoz létre, csak nem olyat, amilyet akartál.

Dehogy vírusokkal! A CRISPR az nem más, mint egy rövid RNS darab. Ennek két része van, mondjuk úgy, hogy van egy "nyele" (ez mindig ugyanaz), és egy "célzó" része (ez mindig más). A Cas9 pedig egy enzim, ami meg tudja fogni a CRISPR-t a "nyelénél" fogva. Ezért hívják teljes nevén CRISPR/Cas9-nak az eljárást.

Vagyis most van egy enzimünk, aminek a "kezében" van egy RNS darab. Ugye az RNS az nem más, mint bázisok sora, olyasmi mint a DNS, csak timin (T) helyett uracil (U) van benne, illetve más a cukor-foszfát gerinc, de az most mindegy. Az RNS bázis-párosodással fel tud ismerni DNS-t, úgy hogy az RNS U-ja a DNS A-jához tapad, a C a G-hez, stb, ugyanúgy ahogy a DNS.

Ha mondjuk egy képzeletbeli RNS csak C-t tartalmasz (CCCCCCC), akkor ez egy olyan DNS-hez tapad, ami csak G-t tartalmaz (GGGGGGG), hiszen a C-k a G-hez tapadnak. Nyilván ha a DNS közepén mondjuk van egy T (GGGTGGG), akkor az RNS ugyanazon pontján A-nak kell lennie (CCCACCC).

A CRISPR úgy működik, hogy a változékony RNS-részt (a "célzót") úgy tervezzük meg, hogy az általunk kiválasztott DNS-szakaszhoz tudjon tapadni. Ez a "programozás", tehát hogy milyen betűket milyen sorrendben rakunk egymás mögé. Ehhez persze ismerni kell a célozni való DNS-részen a betűk sorrendjét, de ha ezt tudjuk, akkor tudunk olyan CRISPR RNS-t tervezni, ami erre tud tapadni. Ilyen RNS-t pedig tudunk csinálni, számítógépen meg lehet tervezni és utána fizikailg le lehet gyártani, és hozzáehet keverni a Cas9 enzimet. Ezt a mesterségesen előállátott RNS-enzim mixet kell befecskendezni a sejtbe. (Ehhez nagyon vékony tűt használnak, mikroszkóp alatt.)

Tehát az van, hogy a Cas9 enzim megragadja a CRISPR RNS-t a nyelénél fogva, a célzó rész pedig az egészet odaviszi a DNS megfelelő pontjára. (Ne feledjük, az RNS a bázispárosodás által oda tud tapadni a megfelelő DNS-hez.) Vagyis mondjuk egy csupa-C CRISPR odaviszi az egész cuccot a csupa-G DNS-hez, és ott lehorgonyozza (ilyen csupa-C a valóságban nincs, ez csak egyszerűsített példa). Mivel egyszerre sok darab ilyen mixet fecskendezünk be, nem pedig csak egy darabot, ezért ha több ugyanolyan pont van a DNS-en, akkor mindegyikre lehorgonyoz egy-egy CRISPR, nem csak arra amelyiket mi szeretnénk. Ezért vannak olyan pontok, amiket igazából nem tudunk megcélozni, mert több hasonló van bennük a genomban. A tervezés legnagyobb részét az teszi ki, hogy a célozni kívánt pont környékén találjunk alkalmas kikötőhelyet, amiből nincs több példány.

A lehorgonyzás után a Cas9 elhasítja a DNS-t. Ennyi történik, ezt tudja a CRISPR/Cas9. Eldarabolja a DNS-t azon a ponton, ahova odaküldtük. Ami ezután történik, azt már a sejt csinálja. A sejt megpróbálja összeragasztani az elhasadt DNS-t, de ez többnyire nem megy hiba nélkül. A hiba legtöbbször az, hogy kimarad pár bázis (kis deléció), de be is épülhet pár extra (kis inszerció). Ha egyszerre két CRISPR-t fecskendezünk a sejtbe, amik egymástól távolabb támadják a DNS-t (ezáltal kivágva egy köztes darabot), akkor a kijavítás során van hogy a köztes darab nem épül vissza, hanem elvész (nagy deléció), esetleg megfordulva épül vissza (inverzió). Aztán olyan is van, hogy az RNS-enzim mixhez hozzákeverünk mesterséges DNS darabokat. Ilyenkor a sejt a CRISPR hasítás után azt hiszi, hogy az a saját DNS-e, és belfoltozza, beleépíti a megjavított DNS-be. Nyilván ha nem keverünk mesterséges DNS-t a keverékbe, akkor ilyesmi nem történik.

Mivel a hasítás után a sejt össze-vissza javítja meg a DNS-t, ezért mindig egyszerre több sejtet kell beecskendezni, és utólag kiválogatni azt, amelyikben a számunkra kedvező változás létrejött.

Tehát a CRISPR egy olyan RNS-enzim komplex, aminek az RNS része felismeri a DNS valamely részét (nevezzük "programozásnak"), és ott az enzim elvágja a DNS-t. A "programozást" az RNS bázis-sorrendje adja, amit mi választunk meg és mi hozunk létre úgy, ahogy akarjuk, ezáltal a CRISPR/Cas9 ott hasít, ahol mi akarjuk. A hasítás után a sejt megfoltozza az elhasított DNS-t, de hibásan, és mi pont ezt a hibát szeretnénk kihasználni.

Ne írj privátban legközelebb, privire nem válaszolok. Követem a kérdést. Amúgy is, talán mások hasznára is válik a kérdés.

Kihozom ide a privátban feltett kérdést, miszerint a Cas9 enzim mesterséges-e vagy természetben előforul.

Ez egy bakteriális enzim, baktériumokban telejesen természetes módon fordul elő, tehát a természetből izolálták.

A bakteriális funkciója a baktériumokat megtámadó vírusok (azaz fágok) elleni védelem. Tehát egyfajta immunrendszer.

A baktériumok persze nem "programozzák" a CRISPR RNS-t, hanem valamilyen fix állapotban található meg bennük. Viszont több különböző fix CRISPR is található bennük.

Ha megtámadja a baktériumot egy fág, akkor a baktériumban levő CRISPR-Cas9 felismeri a fág DNS-ét, odatapad, és elhasítja. A baktériumban ezután nem történik DNS-javítás, nem próbálja megjavítani a fágot. Az elhasított fág ezután már nem működőképes, a baktérium megmenekült a támadástól.

Ez értelemszerűen azt jelenti, hogy a baktérium csak olyan fágok ellen védett, amik ellen van védő-CRISPR az adott baktériumban, azaz a ha az adott támadó fágban van olyan DNS darab, amit valamelyik CRISPR fel tud ismerni. A baktérium tehát akkor jár jól, ha sok különféle CRISPR van benne (ne feledjük, nem tud "tuadtosan" újakat léterhozni), a fág meg akkor jár jól, ha olyan baktériumot tud megtámadni, amiben nincs megfelelő CRSIPR.

Mint látod, a Cas9 enzimnek telejesen mindegy, hogy milyen DNS-t kell megtámadnia, ahova az általa megragadott CRISPR odaköti, ott hasít egyet és kész. Az eredeti helyén fágokat hasogat, de ha kiszedjük a baktériumból és befecskendezzük egy eukarióta petesejtbe, akkor ott hasogatja a DNS-t. A nagy trükk az, hogy a Cas9 enzim bármilyen CRISPR-t fel tud venni, ha az invariáns része (a "nyele") megfelel, az enzimet nem érdekli, hogy a "célzó" rész micsoda. Ezért a baktériumban is van egy csomó különböző CRISPR (habár a baktériumnak be kell érnie azzal, ami benne van, nem tud újat gyártani), mi viszont akármilyen "célzó" részt le tudunk gyártani.

A DNS meg az RNS nem úgy készül, hogy fogsz egy gerincet, és bázisokat pakolsz rá.

Mondjuk képzeld el, hogy van egy csomó hátizsákos ember. Az emberek egyformák (mondjuk mind ikrek), de a hátizsákok különböznek: van piros túrazsák, kék laptoptáska, stb.

Most vegyük úgy, hogy az emberek tornasorba állnak és mindenki megfogja a jobb és a bal szomszéd kezét. Akkor ha most végigmész az emberek háta mögött, akkor csak a hátizsákok lesznek különbözőek, az emberi rész egyforma lesz. Tehát tulajdonképpen kapsz egy hátizsák-sorrendet: kék-kék-kék-piros-zöld stb.

A DNS meg az RNS is ilyen. Ami az emberláncban maga az emberlánc, azt hívjuk gerincnek, a hátizsákok nem a gerinc részei. Az emberláncot sem úgy hoztuk létre, hogy előbb összeálltak lánccá, aztán ki-ki felvett egy hátizsákot. A lánchoz úgy tudunk hozzáadni, ha jön egy új ember, akinek van a hátán valami hátizsák, és megfogja a sorban az utolsó tag kezét.

A DNS meg az RNS abban különbözik, mintha lenne egy csak fiúkból álló láncunk, meg egy csak lányokból álló láncunk (ne feledjük, a lánc emberi része a láncon belül ugyanaz). De a hátizsákok ugyanolyanok, azaz van piros zsákos lány (a lány láncban) és piros zsákos fiú (a fiú láncban).

Amikor RNS-t vagy DNS-t szintetizálnak, akkor tulajdonképpen azt csinálják, hogy fognak egy új hátizsákos fiút, és hozzákapcsolják egy már meglévő fiú-lánchoz. (Vagy ha ő az első, akkor csak megkérik hogy álldogáljon ott, amíg jön a következő.)

Ahogy az ember-láncnál az emberi rész ugyanaz marad, de a hátizsákok sorrendjét befolyásolni tudjuk azzal, hogy milyen sorrendben küldjük be az újabb hátizsákos embereket, ugyanígy RNS vagy DNS szintézisnél is alapegységeket küldönk be egy reakciótérbe egymás után, és ez hozza létre a különböző bázis-sorrendeket.

Végülis RNS-t tehát úgy szintetizálnak, hogy az alapegységeit (a nukleotidokat) megfelelő sorrendben beadagolják egy olyan gépnek, ami megfelelő reakciófeltételeket biztosít. A nukleotidokat pedig ugyanúgy kémiai szintézissel hozzák létre, mint a gyógyszereket vagy egyéb kémiai anyagokat. Nyilván nem atomonként pakolnak össze huszonöt szénatomot tíz oxigénnel, hanem egyes részeket valamilyen természetes forrásból izolálnak, aztán ezekből a megfelelő szintézissel létrehozzák a nukleotidokat.

Nem, mesterséges RNS-t nem csak CRISPR-hez gyártanak. DNS-t, RNS-t napi szinten szintetizálunk évtizedek óta, és sokféle dologra használhatóak.

Itt egy ilyen gép, tud DNS-t és RNS-t is csinálni:

[link]