Mi a QPCR? Miben különbözik a sima PCR -től?

A qPCR és a real time ugyanaz. A Q a quantitative szóból jön. (Azért nevezték át, mert az rtPCR a real time PCR-t és a reverz transzkriptáz PCR-t is rövidíti, ami zavaró volt. Különösen a reverz transzkriptáz real time PCR esetében, ami rtrtPCR rtqPCR meg minden egyéb.)

Nagyon fontos érteni, hogy itt analitikai PCR-ről van szó, azaz arra vagy kíváncsi, hogy egy adott templát DNS benne van-e a mintában. Utána maga a termék téged nem érdekel, eldobod. (Szemben a "sima" szintézis PCR-rel, amikor a terméket akarod használni.) És az analitikai vizsgálatoknál sok esetben nem az a kérdés, hogy van-e valami, hanem hogy mennyi van belőle, azaz a koncentrációja.

A qPCR-t azért találták ki, mert ha csak végpontot nézel (azaz lemegy a PCR, kiveszed a mintákat, és egy gélen megnézed, hogy volt-e termék), akkor csak annyit tudsz mondani, hogy benne volt-e az a bizonyos templát a mintában.

Namost a gélen is látszik, hogy hol erősebb, hol gyengébb a jel, vagyis hol kevesebb, hol több DNS-t kaptál végeredményül. Ez többek között az eredeti templát koncentrációjától is függ, tehát ez alapján már lehet mondani egyfajta koncentráció becslést, csak elég korlátozottan. Az alábbi képen is ezt lehet látni, ahogy egyre több a templát a reakcióban, úgy egyre erősebb a termék:

[link]

Csakhogy igazából ez minket nem elégít ki, mert ez csak egymáshoz képest mutat egy hozzávetőleges sorrendet. És ez a sorrend is elvész, ha túl sok cikluson keresztül csináljuk a PCR-t, mivel akkor a gyengébb jel előbb-utóbb utóléri az erőset. (A termék mennyisége egy idő után telítésbe megy, az egyiknek mondjuk 20 ciklus kell, a másiknak meg mondjuk 25, amiből követlezik, hogy 25 ciklus után már a gyengébb is telítésben van, azaz ugyanolyan, mint az erősebb. A különbség tehát kevés ciklusnál látszik, soknál meg nem.) A képen is látszik, hogy az azonos sorozaton belüli utolsó két minta közt nincs különbség, holott a templátok között volt. Ráadásul ha a leggyengébb koncentrációjú minta még nem is látszik 25 ciklusnál, mert majd csak a 30. ciklusnál jelenik meg detektálható mennyiségű DNS, akkor nem is tudod egyszerre végignézni a teljes koncentrációtartományt, mert vagy az alját nem detektálod, vagy a tetején nem látod a különbséget.

A qPCR esetében ezzel szemben pontosan lehet látni, hogy melyik minta hány ciklus után ment telítésbe. Vagyis akkor is meg tudod mondani a különbséget a különböző mintáid között, ha olyan sok ciklust csinálsz, hogy a legtöményebbek már mind telítésbe mentek azaz gélen már nem látszana a különbség. És ezáltal azt a mintát is meglátod, ami csak késői ciklusszámnál kezd el feljönni. Mindez ráadásul kalibrálhatóan, tehát nem csak egymáshoz mérten tudsz koncentrációt mondani, hanem abszolút értelemben is. És ez nagyon fontos, hogy mást ne mondjak orvosi szempontból: hány kópia vírus van a véredben milliliterenként. Nem az a kérdés, hogy tízszer több-e, mint Józinak, hanem hogy kénkrétan mennyi.

Nagyjából erre jó.