A fehérjéket milyen hőmérsékleten szokták kikristályosítani? Amilyen hőmérsékleten ellátják működésüket, vagy attól teljesen független?

Arra ügyelni kell hogy ne érje irreverzibilis károsodás, de egyébként technikától függő.

Az alábbi cikkben azt írja, hogy 4-45°C között, de van amit 60°C környékén.

[link]

(bal hasáb negyedik bekezdésében)

Alapertelmezes szerint hideg (4C) vagy huvos (16C) szobaban kristalyositunk feherjeket.

A kristalyositasnal egyertelmuen a kristalyositas a prioritas. Ha ekozben megorzi az aktivitasat, az csak plusz... bar ez nem ilyen egyszeru, ha jobban belegondolok. Az egyik random Taq-pol szerkezet (3PO5) kristalyositasat 17C-on vegeztek, szoval egeszen biztos, hogy az aktivitasa nagyon alacsony volt (mivel az optimalis homerseklet ~70C)... mondhatjuk, hogy inaktiv. Ugyanakkor a szerkezet nativ, minden bizonnyal igy nez ki az aktiv enzim is. Egyertelmu, hogy csak nativ szerkezetet van ertelme kristalyositani.

Nehany alapvetes, ami meghatarozza a kristalyositas modjat:

-lehetoleg alacsony homerseklet, amin a feherje nem denaturalodik.

-az alacsony homerseklet kedvez a kirstalyosodasnak, mivel csokken a legtobb kristalyositasra hasznalt anyag oldhatosaga. (A feherjee is!)

-Az alacsony homersekleten novesztett kristalyok altalaban jobb szoraskepet adnak, mivel a homozgas alacsony homersekleten kisebb, a homogenebb lesz a kristalyracs.

-Az alcsony homerseklet csokkenti az esetleges degradacio merteket, ami rontja kristalyosodas eselyet.

-A kristalyositas nem tudomany, leginkabb a konyhamuvesszet kategoriajaba sorolhato: elore egy feherjerol nem lehet megmondani, hogy milyen korulmenyek kozott fog kristalyosodni, probalgatni kell.

"Nem tudom mit jelent az, hogy natív, azt még elmagyaráznád? "

Az a szerkezet, amit a feherjek a sejtben felvesznek, amiben ellatjak a funkciot.

"Ezek szerint a kristályosítási hőmérséklet az véletlenszerű, gondolom a PDB file-okban ez benne van, ugyanakkor a hőmérséklettel emelkedik az atomok helykoordinátáinak szórása is, tehát a PDB file-ban szereplő adatokat ennek megfelelően kell tekinteni, gondolom normálni szokás valahogyan."

Nem normalunk. Egyszeruen egy szamertek, az ugynevezett B-faktor jellemzi, hogy az adott atom mennyire mozgekony. Mekkora a "homerseklete" Szoktak kek-piros szinekkel jelolni, ahol a kek a hideg, stabil, kevesse mozgekony es piros meleg, ahol az atomok jobban mozognak. Ezeket a szamokat akkor kell figyelembe venni a diszkuszio soran, ahol a tul nagy B ertek hatassal lehet az eredmenyre.

"Minél nagyobb az eltérés a fehérje működési és kristályosítási hőmérséklete között, gondolom annál nagyobb az eltérés a mért 3D szerkezet és a vizes közegben lévő valódi között. "

Az osszefugges sajnos nem ilyen egyszeru. A "valodi" szerkezet elterhet amiatt is, hogy a feherjek osszeernek a kristalyracsban. De ezek az elteresek tobbnyire eleg kicsik. A szerkezet egeszere, mint nativ, valodi szerkezetre tekintunk, fuggetlenul attol hogy hany fokon mukodik a feherje. A kristalyosodas valojaban egy rendezett kicsapodas, feltetelezi,hogy a feherjek szerkezete nagyon hasonlo. Ha egy oldatban a feherjek szerkezete denaturalodik, akkor alakjuk szabalytalanna valik, ami ellehetetleniti a kristalyosodast.

"Említetted még az aktivitást is, nem tudom azt miben szokás mérni, és hogyan mérik?"

AZ enzimek aktivitasara olyan sok modszer van,, mint ahany enzim. Tobbnyire valamilyen furmanyos modon kepesek vagyunk merni a szubsztrat fogyasat a reakcioterben. Az idobeli koncentraciovaltozas jelenti a reakcio sebesseget. A legujabb technikak lehetove teszik, hogy az enzim aktivitasat a kristalyban is meg lehet merni, ez nagyon durva. Lehet latni a katalizis lepesei soran atrendezodo oldallancokat.